Sanidad Porcina 11/09

Caracterización de la infección por varios serotipos de salmonella

 

Se han caracterizado las infecciones por salmonellas de algunos de los serotipos más frecuentemente identificados, para obtener información relativa a la importancia clínica de estas infecciones y al grado de adaptación de los diferentes serotipos al hospedador porcino.

 

Salmonella Typhimurium

 

El género Salmonella es un complejo género bacteriano que incluye dos especies, S. enterica y S. bongori. S. enterica se subdivide en 6 subespecies diferentes (Le Minor & Popoff, 1987; Brenner et al., 2000). De todas ellas tan solo una, S. enterica subsp. enterica tiene como hábitat natural el intestino del hombre y los animales domésticos y es responsable de la práctica totalidad de las infecciones en estos hospedadores. En el género Salmonella es fundamental la identificación serológica de los antígenos superficiales.

Según la composición antigénica de los antígenos O o antígenos somáticos, localizados en el lipopolisacárido de la membrana externa de la pared celular, y los antígenos H o flagelares, de naturaleza proteica y constituyentes de los flagelos, se definen un elevado número de serogrupos y serovares/serotipos de salmonella. Según el esquema habitualmente empleado para esta clasificación, esquema de Kauffmann- White, dentro del género Salmonella se incluyen 67 serogrupos o grupos O, definidos por los antígenos somáticos mayores, que a su vez se clasifican en más de 2.500 serotipos diferentes en función de la combinación de antígenos O y H de cada aislado particular. La subespecie entérica de S. entérica es la que presenta una mayor variedad, incluyendo cerca del 60% del total de serotipos descritos.

 

El cerdo, al igual que el hombre, es receptivo a la infección por muy diferentes serotipos de salmonella. En España, de forma semejante a lo que ocurre en otros países del entorno europeo, S. Typhimurium es el serotipo más frecuentemente identificado en muestras porcinas, seguido por S. Rissen, S. Derby y el serotipo monofásico S. 4,5,12:i:- (García et al., 2007). La infección por S. Choleraesuis, único serotipo particularmente adaptado al porcino y responsable de la forma septicémica de la enfermedad que puede asociarse a una elevada mortalidad, es poco frecuente en nuestro país (igual que en la mayoría de los países europeos). El serotipo determina importantes aspectos relacionados con la transmisión, la eliminación, el desarrollo de estados del portador, el cuadro clínico o la respuesta inmunitaria, entre otros muchos. La mayoría de los autores señalan que S. Typhimurium es el responsable de la forma entérica de la salmonelosis porcina (Schwartz, 1999), mientras que el papel de otros serotipos de salmonella como patógenos primarios en el cerdo no está claro.

 

Material y métodos

En el presente trabajo se emplearon un total de 19 cerdos, híbridos comerciales, procedentes de la Granja de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de León distribuidos en cinco grupos experimentales: cuatro de ellos infectados con los diferentes serotipos valorados mientras que un grupo se empleó como testigo sin infectar. Se comprobó adecuadamente que no existía, en ningún momento, eliminación de salmonellas antes del inicio del estudio.

Para cada grupo experimental se emplearon 4 lechones (3 en el grupo control) seleccionados al azar entre las camadas de las cerdas madres monitorizadas. Los lechones se alojaron a las 3-4 semanas de edad en jaulas elevadas con suelo de rejilla con alimentación ad líbitum sin antibióticos. Los animales permanecieron siempre en condiciones de estricta cuarentena para evitar contaminaciones cruzadas y los diferentes grupos experimentales se llevaron a cabo de forma secuencial, igualmente para prevenir contaminaciones cruzadas.

Todas las cepas empleadas habían sido aisladas en nuestro laboratorio y habían sido serotipificadas, y en su caso fagotipadas, en el Laboratorio Nacional de Referencia de Salmonella y Shigella del Instituto de Salud Carlos III de Madrid.

Tras la infección se recogieron muestras de heces, directamente del recto, dos veces por semana y se extrajo sangre (punción de la cava) con periodicidad semanal. Se tomó la temperatura corporal dos veces a la semana durante todo el experimento y se anotó diariamente la presencia de signos clínicos durante la primera semana pos infección (PI). Finalmente, los animales fueron sacrificados en la semana 9 PI (semana 2 PI en el grupo testigo), recogiéndose de forma inmediata y en condiciones de asepsia muestras de: hígado, bazo, riñón, pulmón, corazón, ganglios linfáticos bronquiales, ganglios linfáticos mesentéricos, tonsilas, pared del intestino delgado y pared del colon, además de contenido del colon y del ciego. En los G3 y G4, un animal fue sacrificado en la semana 1 tras la infección. El aislamiento de salmonellas a partir de las muestras de heces o de diferentes tejidos se llevó a cabo siguiendo la Norma ISO (6579: 1993 General guidance on methods for the detection of Salmonella).

Principales signos clínicos observados en el estudio

Grupo

Esperimental

Mortalidad

Diarrea

Letargia

Inapetencia

Hipertermia

G1

25%

100%

si

si

si

G2

0%

0%

no

no

no

G3

0%

0%

no

no

no

G4

50%

100%

si

si

si

Testigo

0%

0%

no

no

no

 

G1: infectado con 9x108 UFC de S. Typhimurium; G2: infectado con 109 UFC de S. Rissen; G3: infectado con 3x1010 UFC de S. Anatum; G4: infectado con 9x108 UFC de S. 4,5,12:i:-; Grupo testigo: 1 ml de caldo BHI estéril diluido en 4 ml de PBS estéril.

Grupos experimentales

Tras un periodo de aclimatación de 2 semanas, todos los animales fueron infectados por vía oral, entre la 5ª y la 6ª semana de edad, con los siguientes aislados y dosis de salmonella:

    Grupo experimental 1 (G1): 1 ml de caldo BHI con 9x108 UFC de S. Typhimurium (4, 5,12: i: 1, 2 fagotipo 104) diluido en 4 ml de tampón fosfato.

    Grupo experimental 2 (G2): 1 ml de caldo BHI con 109 UFC de S. Rissen (6,7:fg:-) diluido en 4 ml de tampón fosfato.

    Grupo experimental 3 (G3): 1 ml de caldo BHI con 3x1010 UFC de S. Anatum (3,10: e, h: 1, 6) diluido en 4 ml de tampón fosfato.

    Grupo experimental 4 (G4): 1 ml de caldo BHI con 9x108 UFC de S. 4, 5,12: i:- (fagotipo U302) diluido en 4 ml de tampón fosfato.

    Grupo experimental 5 (G5): 1 ml de caldo BHI estéril diluido en 4 ml de tampón fosfato.

     

Signos clínicos

Los resultados obtenidos en el seguimiento de los signos clínicos y la evolución de la temperatura corporal en los diferentes grupos experimentales se muestran en la tabla. Tras la infección por S. Typhimurium (G1), todos los animales mostraron una clara letargia, depresión y anorexia a las 48-56 h PI y dos de los cuatro cerdos presentaron diarrea líquida de color amarillo verdoso sin sangre ni restos de material necrótico.

Uno de los cerdos falleció al día 5 PI por un shock septicémico. El resto se recuperaron tras la primera semana PI. Los animales de este grupo mostraron un claro pico de temperatura en el día 3 PI con un valor medio de 41,0º C (DE=0,3º C).

En el G4, infectado con la variante monofásica S. 4, 5,12:i:-, la diarrea comenzó a las 24 h PI en uno de los cerdos. A las 56 h PI, todos los animales de este grupo presentaron un cuadro gastro-entérico grave: diarrea profusa, acuosa y de color amarillo unidos a depresión, letárgia y anorexia. El día 4 PI dos de los cerdos murieron a consecuencia de un shock séptico. La recuperación de los dos cerdos supervivientes se inició en el día 5 PI con la elevación de consumo de pienso, resolviéndose la diarrea al cabo de una semana. Al igual que ocurrió con el G1, tras la infección con la variante monofásica existió un pico de temperatura (día 2 PI), con un valor medio de 41,4 ºC (DE=0,2 ºC).

Por el contrario, tras la infección con S. Rissen (G2) y S. Anatum (G3) la presentación de signos clínicos fue muy limitada. Para ambos grupos, tan solo uno de los animales presentó un ablandamiento ligero de las heces apreciable en los días 3 y 4 y 1 a 3 PI, respectivamente. No se observó ningún cambio en el comportamiento o en el consumo de pienso ni aumento de la temperatura corporal.

 

 

El serotipo determina importantes aspectos relacionados con la epidemiología de las infecciones.

 

Eliminación de salmonella en las heces

Todos los animales del G1, infectados con el serotipo Typhimurium, eliminaron salmonellas en las heces a lo largo de todo el periodo de seguimiento. Tan solo no se detectó eliminación en uno de los cerdos en el día 38 PI. Igualmente ocurrió con los G2 y G4. Tras la infección por S. Rissen, todos los animales eliminaron salmonellas a lo largo de las 8 semanas de seguimiento, mientras que en el caso del G4, infectado con S. 4, 5,12: i:-, tan solo un individuo fue negativo en el día 28 PI.

En el G3, infectado con S. Anatum, la eliminación resultó claramente diferente. Todos los animales del grupo eliminaron salmonellas en las heces durante los tres primeros días PI. Sin embargo, a partir del día 4 PI los lechones mostraron un patrón intermitente, dejando de eliminar en unos muestreos y volviendo a hacerlo en los siguientes. Este patrón se mantuvo durante las 8 semanas de seguimiento, a pesar de que existieron muestreos en los que todos los animales fueron negativos (días 28 y 49 PI).

 

Aislamiento en órganos y tejidos

En los cerdos infectados con S. Typhimurium (G1), la bacteria fue aislada de la mayoría de los tejidos examinados. El único órgano donde no se asilaron salmoneras fue el bazo. La frecuencia más elevada de aislamiento se obtuvo en las tonsilas y en los tejidos y contenidos del intestino, mientras que en pulmón y ganglios linfáticos bronquiales se aislaron Con menor frecuencia.

Tras la infección por S. Rissen (G2), salmonella fue aislada en menor número de órganos y tejidos. Tan solo las tonsilas y el contenido de ciego y colon fueron positivos en todos los cerdos infectados. Con menor frecuencia, se recuperó la bacteria de la pared del colon (50% positivos) y de los ganglios linfáticos mesentéricos (25% positivos). No se aislaron salmonellas de la pared del intestino delgado ni de otros órganos como pulmón, ganglios linfáticos bronquiales, bazo, hígado, corazón y riñones.

La distribución del serotipo Anatum (G3) en los diferentes órganos internos fue similar al G2. Nuevamente, las únicas localizaciones donde el aislamiento resultó positivo en el 100% de los individuos fueron las tonsilas y el contenido del ciego. Además, se aislaron salmoneras con baja frecuencia del pulmón y de los tejidos y contenidos relacionados con el aparato digestivo. Con la única salvedad del pulmón, la bacteria nunca fue aislada de órganos no relacionados con el aparato digestivo.

Finalmente, en los animales del G4, infectados con la variante monofásica S. 4, 5,12: i:-, únicamente pudo determinarse la presencia de salmonellas en los diferentes órganos y tejidos en los animales muertos en la fase aguda de la infección y en ambos casos, la bacteria fue recuperada de la totalidad de las muestras analizadas. Los dos animales restantes de este grupo experimental fueron infectados por otro serotipo de salmonella en la semana 5 PI a consecuencia de una infección cruzada y sus resultados fueron descartados.

 

Discusión

Los resultados del presente trabajo nos permiten afirmar que existen claras diferencias en lo que respecta a la presentación de signos clínicos, la eliminación fecal de la bacteria o el grado de invasión tras la infección experimental por algunos de los principales serotipos de salmonella que afectan al ganado porcino.

En concordancia con lo descrito por otros autores (Wood et al., 1989; Fedorka- Cray et al., 1994), tras la infección por S. Typhimurium los animales mostraron diarrea a las 48 horas de la infección y se resolvió aproximadamente a la semana.

Podemos señalar que la variante monofásica de S. Typhimurium, S. 4, 5,12: i:-, presentó un comportamiento semejante en lo que respecta a esta presentación clínica. Además, la infección por ambos serotipos se asoció a un aumento de la temperatura corporal más marcado tras la infección por el serotipo 4, 5,12: i:-. Este serotipo comenzó a destacar entre los aislados humanos de salmonera en España en 1997 y ha sido asociado a un origen porcino (Echeita et al., 1999; Cruchaga et al., 2001). Los estudios más recientes le sitúan en cuarto lugar en importancia entre los aislados de salmonella obtenidos en cerdos de cebo (García et al., 2007) y su importancia se ve amplificada por el hecho de que se asocia frecuentemente con patrones de multirresistencia.

Tras la infección por S. Rissen o S. Anatum, y a pesar de la elevada dosis empleada, tan solo alguno de los animales mostró heces de consistencia ligeramente alterada durante los primeros días PI, sin que en ningún caso manifestaran, contrariamente a lo sucedido con S. Typhimurium y su variante monofásica, signos generales.

La eliminación de salmonellas en las heces tras la infección por los diferentes serotipos es un parámetro de enorme importancia y fundamental para comprender la transmisión y mantenimiento de esta infección. Los cerdos infectados por S. Typhimurium y S. 4, 5,12: i:- eliminaron salmonellas en la práctica totalidad de las muestras de heces recogidas, igual que con S. Rissen. Sin embargo, S. Anatum mostró un típico patrón de eliminación intermitente, en el que los animales que no eliminaban en un muestreo lo hicieron en posteriores y viceversa.

Así, se muestran claras diferencias con respecto a lo observado por otros autores. Algunos trabajos describen una excreción intermitente (Nielsen et al., 1995; Beloeil et al., 2003) mientras que en ocasiones la eliminación fecal de salmonellas desaparece con relativa rapidez (Fedorka-Cray et al., 1994; Nielsen et al., 1995). Resulta complicado explicar estas diferencias debido a la gran multitud de factores que afectan a la eliminación fecal o el método analítico utilizado y que limitan la posibilidad de establecer comparaciones entre los distintos trabajos. La mayor eliminación de salmoneras en las heces tras la infección en nuestro estudio puede ser consecuencia de una elevada frecuencia de reinfecciones.

La distribución de las salmonellas en los diferentes órganos y tejidos es indicativa de la capacidad invasiva y la virulencia de los diferentes serotipos (Wood et al., 1989; Wood & Rose, 1992; Fedorka- Cray et al., 1994; Nielsen et al., 1995; Cote et al., 2004; Loynachan et al., 2004). En general, las tonsilas fue el órgano donde más frecuentemente se aislaron salmonellas (100% de las muestras positivas) y sólo se aislaron salmonellas a partir del bazo en los tres animales muertos en fase aguda, lo que confirma que éste es un importante órgano diana en las primeras fases de la infección (Barrow, 1999), pero de escasa importancia en las más avanzadas.

En nuestro estudio, S. Typhimurium demostró una elevada capacidad de invasión, mostrando la mayor distribución en órganos internos: el 100% de las muestras relacionadas con el tracto digestivo y el 44,4% del resto fueron positivas, resultado similar al de Loynachan et al. (2004). Por el contrario, la capacidad invasiva de S. Rissen y S. Anatum fue notablemente inferior.

Se ha propuesto que la presencia de salmonella en los ganglios linfáticos mesentéricos está relacionada con el estado de portador (Bahnson et al., 2005). El estado de portador se caracteriza por la ausencia de signos clínicos unida a la capacidad para transmitir la infección y se desarrolla como consecuencia de la interacción de varios factores que incluyen de forma fundamental el serotipo implicado. En nuestro estudio, el serotipo de mayor importancia en este sentido sería Typhimurium, con un 100% de animales positivos en ganglios linfáticos mesentéricos, seguido de Anatum (75%) y, en menor grado, Rissen (25%).

Como resumen, y de la valoración conjunta de todos los datos obtenidos, podemos concluir que existen notables desigualdades en la infección del ganado porcino por diferentes serotipos de salmonella. S. Typhimurium debe ser considerado como un patógeno de importancia clínica y con elevada capacidad de invasión, hecho que se pone de manifiesto en la multitud de órganos en los que se aísla. De forma semejante se comporta su variante monofásica, S. 4, 5,12: i:-, con una entidad clínica clara y un marcado carácter invasivo. Por otra parte, el serotipo Rissen carece de importancia clínica pero su comportamiento de eliminación en las heces tras la infección es indicativo de un elevado grado de adaptación al hospedador porcino y puede explicar su gran importancia epidemiológica y su elevada prevalencia en las granjas de porcino. Finalmente, S. Anatum, al igual que S. Rissen, no da lugar a enfermedad clínica de importancia y tiene una limitada capacidad invasiva. Su comportamiento es completamente diferente en lo que respecta a la eliminación en las heces y es de menor importancia que en el resto de los serotipos estudiados.

 

 

 

Fuentes: Jesús Ángel Collazos Martínez, Carina García Feliz, Laboratorio Regional de Sanidad Animal. León. Ana Carvajal Urueña, Pedro Rubio Nistal Dpto. Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de León. Universoporcino.com.

 

 

 

 

 

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