Reproducción Porcina 11/08

Primeros cerdos nacidos en México a partir de embriones producidos in vitro

RESUMEN

El presente trabajo tuvo dos objetivos: validar las técnicas de maduración in vitro, fertilización in vitro de ovocitos y desarrollo in vitro de embriones porcinos, como una contribución para el desarrollo de las técnicas de reproducción asistida en México; el segundo fue transferir embriones a una hembra receptora, para producir lechones. Los ovocitos se recolectaron a partir de hembras prepúberes y se maduraron en medio definido TCM-199, suplementado con alcohol polivinílico. Los ovocitos madurados se inseminaron en medio amortiguado con Tris y se transfirieron a medio de desarrollo embrionario NCSU-23. Para la primera fase del trabajo, se realizaron siete ensayos con 311 ovocitos, de los cuales 82 % completaron la maduración, y de éstos, 70 % resultaron fertilizados. Se obtuvieron 106 embriones en diferentes etapas del desarrollo y 14 % de estos alcanzaron el estado de blástula. En la segunda fase del trabajo, se transfirieron por vía quirúrgica 49 embriones en diferente estado de desarrollo, al cuerno uterino de una hembra receptora previamente sincronizada. Se detectó la gestación por medio de ultrasonografía 55 días después de la transferencia. A los 114 días y medio después de la fertilización, nacieron por cesárea dos hembras vivas con apariencia y peso normales.

 

 

Las investigaciones sobre fertilización in vitro (FIV) se iniciaron al final de la década de 1950, cuando se produjo el nacimiento de conejos por esta técnica. Aunque la FIV progresó rápidamente en especies de mamíferos de laboratorio, su desarrollo fue más lento en las especies domésticas, ya que el nacimiento de la primera ternera mediante FIV se logró en 1982. Estos veinte años de retraso fueron consecuencia de problemas metodológicos, ya que las condiciones requeridas para la capacitación espermática, la maduración in vitro (MIV) de ovocitos y el desarrollo embrionario pre implantación, difieren entre las diversas especies de mamíferos. La demanda de la FIV en varias especies domésticas se ha incrementado debido al desarrollo de técnicas de transgénesis mediante las cuales, es posible introducir genes específicos en el genoma de animales como bovinos, ovinos y porcinos. Estas técnicas requieren la producción de un alto número de embriones en los que se puedan llevar a cabo estas manipulaciones.

 

Los cerdos representan un modelo apropiado para la creación de animales transgénicos, con el fin de elaborar productos biológicos y obtener órganos para xenotrasplantes, debido a que presentan aspectos fisiológicos, anatómicos y bioquímicos similares a los de los seres humanos, y los órganos obtenidos de cerdos transgénicos tendrían una aplicación para trasplantes en humanos. Algunos cerdos transgénicos son capaces de sintetizar proteína C, hemoglobina y sustituto de sangre humanas. Existen trabajos que describen la producción de ratones transgénicos, en los que se ha transferido la resistencia a enfermedades parasitarias como la cisticercosis, con base en la identificación de genes candidatos de resistencia en un modelo murino, que podría ser aplicado al porcino.

 

Para incrementar la eficiencia y reproducibilidad en la MIV y FIV, así como en el desarrollo embrionario, se han creado medios definidos. El fluido folicular porcino y el suero fetal bovino han sido eliminados de estos medios como fuente de nutrimentos, debido a la complejidad de su composición y a la variabilidad que existe entre ellos, por lo que se han remplazado por componentes como el alcohol polivinílico (PVA) y suplementos como cisteína, glucosa, piruvato de sodio, factor de crecimiento epidérmico (EGF), LH y FSH. Aunque se ha progresado en este campo, hay pocos informes de nacimientos de cerdos producidos por MIV y FIV, en los que se describan la transferencia de embriones (TE) en diferentes estados de desarrollo embrionario. En México no existen trabajos en los que se haya logrado el nacimiento de lechones por medio de estas técnicas.

En este trabajo los objetivos fueron dos: el primero fue validar las técnicas de MIV, FIV y el desarrollo de embriones porcinos in vitro. El segundo, obtener embriones in vitro para transferirlos a una hembra receptora y producir lechones.

 

Para cumplir el primer objetivo los ovarios se colectaron en el rastro, a partir de cerdas pre púberes y se transportaron al laboratorio en menos de dos horas, en solución de NaCl al 0.9 % a 25 °C (A menos que se especifique lo contrario, los reactivos empleados fueron de la marca Sigma). Folículos ováricos de 3 a 6 mm se puncionaron para la obtención del fluido folicular, que se dejó sedimentar para obtener el paquete celular, que fue lavado dos veces con medio modificado de Tyrode suplementado con lactato de sodio 10 mM, HEPES 10 mM y PVA 1mg/ml (TL-HEPES-PVA). Se seleccionaron los ovocitos con citoplasma uniforme y granular, y rodeados de una masa compacta de células del cúmulo; se lavaron tres veces en medio de maduración (TCM-199 con sales de Earle y bicarbonato de sodio 26.2 mM) libre de proteínas, suplementado con D-glucosa 3.05 mM, piruvato de sodio 0.91 mM, PVA 0.1 %, cisteína 0.57 mM, EGF 10ng/ml, LH 0.5 μg/ml y FSH 0.5 μg/ml. De 40 a 50 ovocitos se transfirieron a cajas de cuatro pozos (Nunc), que contenían 500 μlde medio de maduración libre de proteínas, cubierto con aceite mineral (Fisher) y se incubaron a 39 °C con 5 % de CO2 en aire y humedad a saturación por 44 h. Después de la MIV, las células del cúmulo fueron removidas con hialuronidasa al 0.1 % en TCM-199.

 

Los ovocitos desnudos se lavaron dos veces con medio de maduración y tres veces con medio de FIV en gotas de 500 μl y cubiertas con aceite mineral. Este medio, designado como medio amortiguado con Tris (TBM), está compuesto por NaCl 113.1 mM, KCl 3 mM, CaCl2 2 H2O 7.5 mM, Tris 20 mM, glucosa 11 mM, piruvato de sodio 5 mM, albúmina sérica bovina (BSA) 0.4 % y cafeína 2.5 mM. Para la FIV, se colocaron de 30 a 35 ovocitos en gotas de50 μl de medio TBM cubiertas con aceite mineral y se incubaron a 39 °C con 5 % de CO2 en aire y humedad a saturación, por 45 min hasta la inseminación (9,10).

 

La muestra de semen se obtuvo mediante el método de la mano enguantada y se transportó a 39 °C al laboratorio, donde fue diluida 1:1 con solución salina de fosfatos (PBS-Dulbecco. Gibco), suplementada con BSA fracción V al 0.1 %, 75 μg/ml de penicilina potásica G y 50 μg/ml de sulfato de estreptomicina.

Esta suspensión se centrifugó a 61 xg durante 5 min. El sobrenadante se diluyó 1:1 con PBS Dulbecco y se centrifugó a 1,900 xg por 5 min. El sobrenadante se desechó y el paquete celular, conteniendo los espermatozoides, se resuspendió en 10 ml de PBS Dulbecco y se centrifugó a 1,900 xg por 5 min. El paquete celular se diluyó con 100 μl de TBM y se hizo una dilución para que, al agregar 50 μl de la suspensión de espermatozoides a la gota del medio de FIV con los ovocitos, se obtuviera una concentración final de 5 x 105 espermatozoides por ml. Las células se colocaron en incubación en las condiciones antes descritas durante 7 h.

 

Después del periodo de coincubación, los ovocitos se lavaron tres veces en gotas de 50 μl de medio North Carolina State University-23 (NCSU-23) suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 0.4 %; se transfirieron a gotas de 500 μl del mismo medio cubiertas con aceite mineral en placas de cuatro pozos, y se incubaron en las mismas condiciones durante 12 h. Posteriormente, se lavaron en medio TL-HEPES-PVA y se prensaron entre un portaobjetos y un cubreobjetos para fijarlos con ácido acéticoetanol (J.T. Baker) (1:3) por 72 h. Los ovocitos se tiñeron con una solución de orceína al 1 % en ácido acético (J.T. Baker) al 45 %. Las preparaciones se evaluaron en el microscopio de contraste de fases a un aumento de 400x (9). Los ovocitos con vesícula germinal o cromosomas en la primera metafase se consideraron inmaduros, los que mostraron cromosomas en la segunda metafase y presentaron el primer cuerpo polar, se consideraron como maduros, y aquéllos que presentaron dos o más pronúcleos, como fertilizados. Después de 7 h de coincubación, los ovocitos fertilizados que se utilizaron para evaluar el desarrollo embrionario se lavaron de la forma mencionada, se transfirieron a gotas de 500 μl de medio NCSU-23 y se incubaron a 39 °C en atmósfera húmeda y 5 % de CO2 en aire. A las 48 y 120 h de incubación, se observaron los embriones para determinar su estado de desarrollo.

 

Se realizaron siete ensayos de MIV, FIV y desarrollo embrionario. De un total de 311 ovocitos empleados, 256 (82 %) completaron la maduración y de estos, 178 (70 %) resultaron fertilizados. Se obtuvieron 106 embriones en diferentes etapas del desarrollo y 15 (14 %) de ellos alcanzaron el estado de blástula. El porcentaje de polispermia fue del 35 %.

 

Una vez establecidas las condiciones de MIV, FIV y desarrollo embrionario, se procedió a realizar el segundo objetivo, y se usó como receptora una hembra nulípara de línea genética comercial, en la que se registraron tres ciclos estrales regulares. De los días 12 al 17 del cuarto ciclo estral, se le administraron diariamente por vía oral 20 mg de Altrenogest (Hoescht Marion-Rousell). Los días 18 y 20 se le administraron, por vía intramuscular, 1500 UI de eCG y 7500 UI de hCG (Intervet). Se registró el día y la hora en que la hembra presentó calor. Cinco y medio días después del último estro, se realizó la TE, procurando sincronizar de esta forma el estado de desarrollo de los embriones en etapa de mórulas y blástulas tempranos (6 a 7 días), con el medio ambiente uterino de la receptora.

 

Veinticuatro horas antes de la cirugía, se le suspendió la ingesta de alimento y agua a la hembra receptora para vaciar el contenido del aparato digestivo; posteriormente, se procedió a tranquilizarla con 2 mg/kg de peso de Sural (Asaperona, Intervet), para posteriormente aplicarle 7 mg/kg de peso de metomidil (clorato de metomidato, Chinoin). Después de anestesiada, se realizó la laparoscopía de acuerdo a la técnica de Legendre y Boussea ; una vez en la cavidad abdominal, se procedió a localizar el útero y a ubicar los ovarios, para contar los cuerpos lúteos de cada uno.

 

Los embriones se transportaron al quirófano en menos de una hora, en gotas de 50 μl de medio NCSU-23 cubiertas con aceite mineral, en placas de cuatro pozos a 39 °C protegidos de la luz. Una vez en el quirófano se observaron y se cargaron en un catéter bajo el microscopio estereoscópico. Posteriormente, los embriones se transfirieron a la punta del cuerno uterino ipsolateral al ovario con mayor número de cuerpos lúteos. Se puncionó el cuerno uterino con un angiocatéter para depositar los embriones en la luz uterina. El cuerno se regresó a la cavidad abdominal y se suturaron la fascia muscular y la piel. El diagnóstico de gestación se realizó por medio de ultrasonido (tiempo real-arreglo lineal) con un transductor de 5 MHz (E.I. Medical). Se utilizó un solo lote de embriones obtenidos por FIV que alcanzaron las siguientes etapas de desarrollo: 10 blástulas expandidas, 27 mórulas y blástulas tempranas, y 12 en estados tempranos de desarrollo (8 a 16 células). Todos fueron transferidos al cuerno uterino de la hembra receptora. Después de la TE, la hembra no presentó estro, se utilizó el ultrasonido a los 55, 69, 90 y 107 días, para evaluar el avance de la gestación. Transcurridos 114 días y medio después de la FIV, o 109 días después de la TE, la hembra no presentó síntomas de parto, por lo que se procedió a realizar una intervención quirúrgica de la que se obtuvieron dos hembras vivas, con pesos de 1.5 y 1.0 kg respectivamente, con apariencia y tamaño normales. Los medios de maduración de ovocitos son suplementados convencionalmente con fluidos biológicos, como fluido folicular y suero fetal, que estimulan la maduración; sin embargo, contienen moléculas no caracterizadas, que pueden ejercer un efecto inhibitorio en la maduración, dando como resultado una gran variabilidad en la producción de embriones. En el medio de maduración empleado en este estudio se sustituyeron el suero fetal bovino y el fluido folicular por PVA, suplementado con EGF. Se ha demostrado que la MIV de ovocitos de cerdo en medios definidos, produce embriones viables. En estudios previos, se han transferido embriones recién fertilizados o de dos a cuatro células en el oviducto, o embriones de ocho células o mórulas en el cuerno uterino.

 

En el presente estudio se transfirieron 49 embriones en diferentes etapas de desarrollo, a un solo cuerno  uterino. La transferencia de todos los embriones a un solo cuerno uterino se debió al hecho de que en la cerda los embriones tienen la capacidad de migrar a ambos cuernos. Por otra parte, las razones de transferir embriones en diferentes estadios de desarrollo a una sola hembra receptora, fueron la disponibilidad de una sola hembra para realizar este experimento, y que el objetivo final era el de lograr la producción de lechones, sin importar la cantidad de los embriones utilizados.

 

Se ha informado que muchos embriones no se implantan o son reabsorbidos, por lo que un alto número de embriones debe ser transferido para que algunos de ellos puedan llegar al final de la gestación. Transfirieron 75 embriones en estado de dos a cuatro células, desarrollados in vitro, a los oviductos de una hembra receptora; 114 días después nacieron tres hembras. En otro estudio, se transfirieron 380 embriones en estado de dos a cuatro células a los oviductos de ocho hembras receptoras (48 embriones en cada receptora), cuatro de ellas resultaron preñadas, pero sólo una produjo nueve lechones vivo. Se transfirieron 50 embriones recién fertilizados y de 24 h de desarrollo a cuatro hembras, y obtuvieron solamente tres lechones vivos. En cambio, en otro trabajo se transfirieron de 20 a 25 embriones en estado de blástula a cuatro hembras receptoras, las cuales produjeron un total de 21 lechones.

 

Aunque en el presente estudio se logró el nacimiento de sólo dos lechones, es probable que los otros embriones hayan contribuido para lograr el rescate de los cuerpos lúteos y mantener la gestación de los dos productos.

Todos los embriones transferidos fueron del mismo lote; a los 6 días posteriores a la fertilización no todos llegaron a la etapa de blástula, como era lo esperado, pero podemos afirmar que a la hora de la transferencia todos estaban vivos, ya que en lotes utilizados como testigo, al hacer pruebas de viabilidad con MTT (Metiltiazoltetrazolio), se observó que los embriones en estado temprano de desarrollo (8 a 16 células) permanecieron vivos, aún cuando sus contemporáneos hayan alcanzado la etapa de blástula. Por otra parte, es probable que los embriones que continuaron el desarrollo hasta término, hayan sido aquéllos con una sincronización más cercana con la receptora, es decir, las mórulas y las blástulas

Los resultados obtenidos coinciden con los descritos por Yoshida, quienes mencionan que la transferencia de un alto número de embriones debe proporcionar protección durante la gestación, para evitar la pérdida de productos. Las dos hembras que nacieron fueron aparentemente normales, y su peso fue semejante al que se obtiene por medios naturales.

 

En un estudio similar al presente, se logró obtener en dos hembras receptoras, el nacimiento de nueve lechones con pesos de 1.0 a 1.5 kg, empleando FIV y TE a un cuerno uterino de una hembra receptora. En México se han llevado a cabo estudios utilizando la metodología de FIV en cerdos, sin embargo, no se han reportado transferencias de embriones ni gestaciones producidas por esta técnica. Este es el primer trabajo en el que se logra el nacimiento de lechones vivos por MIV, FIV y TE. Los resultados obtenidos en este estudio podrán contribuir al desarrollo nacional de metodologías de reproducción asistida para la producción de cerdos.

 

AGRADECIMIENTOS

Se agradece al M. en C. Marco Bonilla, al M. en C. Héctor Zayas y al MVZ Rubén Ramírez su apoyo técnico, a la Dra. María Elena Trujillo su asesoría en la sincronización hormonal de la hembra, al MVZ Ricardo García García por el apoyo en la anestesia, al MVZ Jesús Paredes Pérez por la realización de la cesárea a la cerda, y al Rastro Los Arcos, Los Reyes, Estado de México, México, por la donación de los ovarios. Proyecto parcialmente apoyado por el CONACyT convenio 1470 a MB.

 

 

Fuentes: Yvonne Claudine Ducolom Ramírez, Salvador Romo García, Juan Alberto Balcázar Sánchez, Luis Felipe Rodarte Covarrubias, Eduardo Casas Hernández, Gladis del Carmen Fragoso González,  Lidia Sciutto Conde, Miguel Betancourt Rule.

Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco 186, 09340, Iztapalapa, D.F. México.

Departamento de Posgrado, Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM.

Departamento de Reproducción y Departamento de Etología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM.

Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM.

 

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