Actualidad porcina 12/19

 

Primera vacunación oral del jabalí euroasiático contra el virus de la peste porcina africana Genotipo II

 

La peste porcina africana (PPA), la amenaza más importante para la industria porcina mundial, se ha extendido a más de 55 países en tres continentes, y afecta a más del 77% de la población porcina mundial. En la Unión Europea, jabalí (Sus scrofa) es el host más gravemente afectado. Las principales razones de la propagación constante y sin precedentes de la PPA en Europa son las actividades comerciales, el movimiento continuo de las poblaciones de jabalíes infectados entre regiones y la falta de vacunas para prevenir la infección por PPA. En este estudio, demostramos que la inmunización oral del jabalí con un virus ASF atenuado no hemadsorbing del genotipo II aislado en Letonia en 2017 (Lv17 / WB / Rie1) confirió una protección del 92% contra el desafío con un aislado virulento del virus de la ASF (Arm07 ) Este es, según nuestro conocimiento, el primer informe de una vacuna prometedora contra el virus de la PPA en jabalíes por administración oral. Otros estudios deberían evaluar la seguridad de la administración repetida y la sobredosis.

 

Materiales y métodos

Animales

Se obtuvieron 18 lechones de jabalí hembra de 3 a 4 meses de edad y con un peso de 10 a 15 kg de una granja comercial de jabalíes en Extremadura, España. Los lechones no habían sido vacunados contra ninguna enfermedad infecciosa. El jabalí de este sitio resultó negativo para los siguientes patógenos porcinos principales en la región: virus Aujeszky, Mycobacterium bovis, Mycoplasma pneumoniae y circovirus porcino tipo 2. Los lechones se mantuvieron en las instalaciones de biocontención BSL-3 del Centro VISAVET en la Universidad Complutense de Madrid. Se permitió que los animales se aclimataran durante 2 semanas antes de que comenzaran los experimentos. Durante el juicio, el jabalí tenía ad libitumacceso a comida y agua. Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo las normas europeas, nacionales y regionales y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Comunidad de Madrid (referencia PROEX 124/18).

 

Aislamientos de ASFV

El atenuado, no hemadsorbing p72 genotipo II ASFV Lv17 / WB / Rie1 se utilizó para la vacunación. Esta cepa había sido probada previamente en cerdos domésticos ( 25 ). El fenotipo distintivo no hemadsorbente está relacionado con un aclaramiento único de adenosina que genera una proteína truncada a partir de la secuencia codificante similar a CD2 en el gen EP402R (patente española PCT / 2018/000069). Esta deleción corresponde a la posición del gen 395 en el genoma de referencia ASFV Georgia 2007/1 hemadsorbing (GenBank FR682468). El virus se cultivó durante 7 días en monocitos de sangre porcina ( 26), luego se recogió el medio de cultivo que contenía virus extracelular, se centrifugó a baja velocidad para eliminar los restos celulares y luego a alta velocidad para sedimentar el virus. El sedimento se suspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se tituló en monocitos de sangre porcina y se usó en experimentos de protección. El título viral se definió como la cantidad de virus que causa efectos citopáticos en el 50% de los cultivos infectados (TCID50 / ml), según lo estimado por la tinción con inmunoperoxidasa.

Para los experimentos de desafío, se usó la cepa Arm07 de genotipo II de ASFV virulento y hemadsorbente ( 23 ). El virus se propagó en monocitos de sangre porcina como se describe ( 23 ). El título viral se definió como la cantidad de virus que causa la absorción hema en el 50% de los cultivos infectados (HAD50 / ml / TCID50 / ml).

 

Inmunización y Desafío de Jabalí

Doce lechones de jabalí fueron alojados en las instalaciones de BSL-3 para llevar a cabo la prueba de vacunación. Inicialmente, nueve jabalíes fueron vacunados por vía oral con 10 4 TCID50 de Lv17 / WB / Rie1 ASFV. Posteriormente, los tres jabalíes restantes se expusieron a los lechones vacunados por vía oral por contacto (en lo sucesivo denominado VContact) de 0, 7 y 15 días después de la vacunación para evaluar la transmisión de la vacuna en diferentes momentos.

El período de vacunación duró 30 días para permitir el desarrollo de una respuesta inmune. Luego, se usó un modelo de infección por exposición a la exposición de cerdo y shedder para evaluar la inmunidad protectora: los animales vacunados se expusieron a cuatro jabalíes (animales de shedder). Estos animales sin tratamiento previo se inocularon por vía intramuscular con 10 HAD50 de ASFV Arm07 el mismo día que los controles desafiados por vía intramuscular. También a los 30 días después de la vacunación, se usaron dos jabalíes como animales en contacto tardío: los animales no expuestos fueron expuestos a todos los demás animales, y se midió la transmisión de la vacuna o el virus de desafío.

Los 12 animales vacunados, cuatro jabalíes desafiados por vía intramuscular con Arm07, y dos jabalíes en contacto tardío sin contacto se mantuvieron durante 24 días después de la exposición, lo que corresponde a 54 días después de la vacunación.

Durante este tiempo, el movimiento de los animales fue monitoreado 24 ha día por cámara de video. Los signos clínicos se registraron diariamente como se describe ( 5 , 23 ); Estos signos incluyeron anorexia, recumbencia, hemorragia cutánea o cianosis, hinchazón de las articulaciones, dificultad respiratoria, secreción ocular y hallazgos digestivos. Se recogieron muestras de sangre y suero de EDTA emparejadas dos veces por semana. La temperatura rectal se midió dos veces por semana antes de tomar muestras de animales, así como en animales que muestran signos clínicos después de la vacunación. La presencia del genoma de ASFV en sangre se determinó mediante PCR en tiempo real ( 27 ). Las muestras de suero se analizaron para detectar anticuerpos usando una prueba ELISA comercial (Ingenasa-Ingezim PPA Compac K3; Ingenasa, Madrid, España) y usando una prueba de inmunoperoxidasa indirecta (IPT) ( 13).)

 

Necropsia y Recolección de Muestras

Al final del período de observación (54 días después de la vacunación), los animales sobrevivientes fueron anestesiados mediante inyección intramuscular de una combinación anestésica de tiletamina-zolazepam (Zoletil® 100 mg / ml, Virbac, Francia, dosis objetivo 3 mg / kg) y medetomidina. (Medetor®, Virbac, Francia, dosis objetivo de 0,05 mg / kg) ( 28 ), luego se sacrificó por inyección intravenosa de T61. Se realizó un examen post mortem completo para detectar la presencia de lesiones macroscópicas compatibles con la PPA. Se obtuvieron dieciséis tejidos diferentes (enumerados en la Tabla 1 ), incluidos todos los ganglios linfáticos principales y los órganos viscerales diana, de cada animal necropsiado y se probaron mediante PCR en tiempo real para detectar ASFV. El aislamiento del virus se realizó a partir de un subconjunto de tejidos, utilizando procedimientos establecidos ( 29) Las muestras se pasaron a ciegas tres veces, y las placas se examinaron para detectar hemadsorción durante 6 días. Si se encontraron lesiones compatibles con ASF, se clasificaron según su distribución e intensidad.

 

 

Tabla 1. Lista de tejidos post mortem probados para el ADN del virus de la peste porcina africana mediante PCR en tiempo real.

 

Análisis estadístico

Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox se utilizaron, respectivamente, para calcular la probabilidad de muerte y para detectar diferencias significativas de supervivencia entre los grupos. La prueba U de Mann-Whitney y la correlación de rango de Spearman se usaron para comparar los valores de Ct de la PCR en tiempo real entre los grupos de tratamiento. Los datos se analizaron utilizando SPSS 20 (IBM, Somar, NY, EE. UU.) A un nivel de significación de 0,05.

Resultados

Resultados durante el período de vacunación

Durante el período de vacunación de 30 días, seis de nueve animales vacunados por vía oral fueron positivos para anticuerpos anti-ASFV basados ​​en pruebas ELISA e IPT a partir de 15 ± 3 días después de la vacunación ( Figura 1 ). Los tres jabalíes VContact mostraron una respuesta positiva de anticuerpos a partir de 14 ± 2 días después del contacto, y los títulos permanecieron altos durante todo el experimento ( Figura 1 ). Estos resultados indican que la cepa Lv17 / WB / Rie1 administrada por vía oral puede inducir una respuesta de anticuerpos en el jabalí.

 

 

Figura 1 . Títulos de anticuerpos contra el VPPA en jabalíes vacunados por vía oral con Lv17 / WB / Rie1 (gris) y jabalíes expuestos por contacto con animales vacunados (azul). Los últimos animales fueron expuestos por contacto a partir de 0 días (ID7 del animal), 7 días (ID10) y 15 días (ID17) después de la vacunación. Los títulos se determinaron usando la prueba de inmunoperoxidasa indirecta.

 

 

No se detectaron signos clínicos compatibles con ASF en animales inmunizados con Lv17 / WB / Rie1. La única reacción clínica detectada fue un ligero aumento de la temperatura corporal a 40.1–40.8 ° C en siete de nueve animales vacunados y en uno de los tres animales VContact, que duró un promedio de 3.5 días entre 4 y 24 días después de la vacunación ( Figura 2 ) . La viremia alcanzó su punto máximo en diferentes días en los animales. En seis de nueve animales vacunados por vía oral y dos de tres jabalíes VContact, la PCR en tiempo real mostró resultados débilmente positivos (Ct = 33.02 ± 4.07) durante el período de vacunación de 30 días. Los picos de viremia mostraron una correlación débil con el ligero aumento de la temperatura corporal ( Figura 2 ).

 

Resultados después del desafío

La respuesta inmune en animales vacunados y VContact protegidos contra Arm07. Después de la exposición al desafío, 11 de los 12 animales vacunados y VContact sobrevivieron (92%). Además, ninguno de ellos desarrolló signos clínicos compatibles con ASF o lesiones macroscópicas después del desafío. Dos animales vacunados por vía oral que no habían mostrado respuesta de anticuerpos anti-ASFV o un aumento en la temperatura corporal durante el período de vacunación de 30 días desarrollaron picos de viremia intermitentes después del desafío. Mostraron una respuesta positiva de anticuerpos a los 3 y 7 días después de la exposición, correspondiente a 33 y 37 días después de la vacunación.

En contraste, todos los controles que recibieron desafío intramuscular desarrollaron signos clínicos severos compatibles con la PPA ( Figura 2 ). Estos animales murieron o fueron sacrificados entre 7 y 20 días después de la infección (Mantel-Cox, χ 2 = 18.88, 1 df; p <0.001). Los dos animales en contacto tardío mostraron signos clínicos similares a los de los controles desafiados por vía intramuscular ( Figura 2), excepto que los animales en contacto tardío desarrollaron respuestas de anticuerpos a los 7 y 9 días después del desafío y posteriormente recuperaron su estado previo al desafío y sobrevivieron. El único animal vacunado por vía oral que no sobrevivió al desafío desarrolló una forma clínica de PPA similar a la observada en los controles con desafío intramuscular. Este jabalí nunca mostró una respuesta de anticuerpos.

 

Todos los animales de control con exposición intramuscular mostraron viremia a partir de los 6 a 12 días posteriores a la exposición hasta la muerte (Ct = 23,65 ± 4,68). Los dos animales en contacto tardío mostraron viremia desde 6 u 11 días después del desafío hasta 21 días (Ct = 32.74 ± 1.11). Cuatro de los ocho animales sobrevivientes vacunados por vía oral y uno de los tres jabalíes VContact mostraron esporádicamente picos de viremia débiles después del desafío (Ct = 34.56 ± 1.60). El animal vacunado por vía oral y sin protección contra el desafío desarrolló una viremia de valores de Ct similares a los controles desafiados por vía intramuscular (Ct = 26.31 ± 1.73). En general, los valores de Ct de viremia de la PCR en tiempo real fueron significativamente mayores en los animales supervivientes que en este animal sin protección o en los controles con exposición intramuscular ( prueba U de Mann-Whitney , Z = −2.84, p<0.01) ( Figura 2 ).

Los análisis post-mortem revelaron hallazgos patológicos compatibles con ASF solo en los animales vacunados sin protección vacunados y los controles desafiados intramuscularmente. Los principales hallazgos de la necropsia fueron acumulación moderada a severa de líquido de amarillento a rojizo en la cavidad abdominal (ascitis), en el tórax (hidrotórax) y en el saco pericárdico (hidropericardio). Se observó congestión general y hemorragias focales en la superficie pulmonar, bazo (esplenomegalia), ganglios linfáticos (linfadenitis hemorrágica), riñones, mucosa vesical (cistitis hemorrágica difusa) y mucosa gástrica ( Figuras 3 , 4 ).

 

Figura 3 . Vistas de las cavidades torácica y abdominal de (A) jabalí vacunado por vía oral con Lv17 / WB / Rie1 y (B) control desafiado intramuscularmente con ASFV Arm07 virulento. Hidrotórax, hepatomegalia y esplenomegalia son evidentes en (B) .

 

 

 

La Figura 4 . Vista de estudio del saco pericárdico (I), riñón (II) y superficie de la mucosa del intestino (III) de (A) jabalí vacunado por vía oral con Lv17 / WB / Rie1 y (B) controles desafiados intramuscularmente inoculados con ASFV Arm07 virulento. (B) Muestra hidropericardio (IB), riñón congestivo con hemorragias multifocales agudas que van desde hemorragias petequiales a equimóticas en la superficie de la corteza (IIB), y numerosas petequias agudas en la superficie mucosa del colon (IIIB).

 

 

El ADN genómico de ASFV no se detectó en ninguno de los 16 tejidos analizados en tres de los ocho animales sobrevivientes vacunados por vía oral y dos de los tres animales VContact. Los animales restantes que sobrevivieron mostraron resultados de PCR débilmente positivos (Ct = 38.416 ± 1.16) en un promedio de 5 tejidos. El VPPA podría aislarse de solo dos de los 22 tejidos analizados de estos animales: ganglio linfático retrofaríngeo en un animal vacunado y ganglio linfático renal en un animal VContact. Estos aislados de virus no eran hemadsorbadores. Los dos jabalíes en contacto tardío mostraron resultados de PCR débilmente positivos en 9 o 12 tejidos (Ct = 37,40 ± 0,43), donde el ASFV hemadsorbedor se aisló solo de un ganglio linfático inguinal. En contraste, se detectó ADN viral en casi todos los 16 tejidos analizados de cuatro animales desafiados intramuscularmente, y los niveles fueron significativamente más altos (Ct = 21.59 ± 1.Prueba U , Z = −2.65, p <0.01). En este caso, el ASFV hemadsorbing se aisló de varios tejidos. De manera similar, el animal vacunado por vía oral que permaneció sin protección contra la exposición mostró resultados de PCR muy positivos (Ct = 23,32 ± 1,60) en los 16 tejidos analizados. Estos resultados se resumen por tejido y animal en la Figura 5 . La carga del genoma viral se correlacionó inversamente con el intervalo entre la última viremia detectada y el análisis post mortem (correlación de rango de Spearman, r = −0.853, p <0.001; Figura 6 ).

 

La Figura 5 . Niveles de ADN de ASFV (valores de Ct de PCR en tiempo real) en tejidos post mortem de animales vacunados oralmente con Lv17 / WB / Rie1 (azul oscuro), expuestos por contacto (VContact, azul claro), controles desafiados intramuscularmente inoculados con ASFV Armulento virulento07 (rojo) y jabalí en contacto tardío (gris). El único animal vacunado por vía oral que no sobrevivió al desafío (ID11) dio resultados muy positivos en varios tejidos (Ct = 23.32 ± 1.60), similar a los controles con desafío intramuscular.

 

 

La Figura 6 . Comparación de los niveles de ADN de ASFV (valores de Ct de resultados de PCR en tiempo real) en 16 tejidos post mortem con el número de días desde la última viremia detectada hasta la necropsia. Los valores de Ct están inversamente relacionados con el nivel del genoma del virus.

 

 

Discusión

En condiciones experimentales, se probó un nuevo campo aislado de ASFV naturalmente atenuado (cepa Lv17 / WB / Rie1) ( 25 ) como candidato a vacuna para jabalí. Como el objetivo de esta vacuna sería el jabalí en el campo, consideramos de gran interés utilizar dicha vacuna prototipo mediante administración oral, demostrada en experiencias exitosas pasadas (es decir, inmunización oral contra la peste porcina clásica del jabalí en Alemania) ( 30).) Nuestros resultados mostraron que la cepa Lv17 / WB / Rie1 protegió el 92% de los animales vacunados por vía oral y VContact contra la exposición con el aislado virulento Arm07. Esta protección se tradujo no solo en la supervivencia animal sino también en la ausencia de signos clínicos, hallazgos patológicos y detección de virus compatibles con ASF en tejidos diana. La vacuna candidata sería la primera vacuna oral contra el ASFV genotipo II probada en jabalí. El uso potencial de esta vacuna en el campo tendría como objetivo reducir el número de animales susceptibles, aumentar la inmunidad del rebaño en las poblaciones de jabalíes y, por lo tanto, disminuir la incidencia de PPA.

 

Este completo estudio in vivo proporciona detalles sobre hallazgos clínicos y patológicos, respuestas de anticuerpos, períodos de viremia y detección de virus de ADN en 16 tejidos y órganos diana. Al comparar estos resultados con estudios experimentales previos de vacunas candidatas probadas en cerdos domésticos, se destaca la eficacia protectora contra un genotipo II de ASFV de desafío virulento no parental (véase la Tabla 1 complementaria ). Aunque nuestros resultados se obtuvieron con un tamaño desequilibrado de grupos de animales, el alto efecto protector en el jabalí observado en este estudio es consistente con los resultados anteriores obtenidos con Lv17 / WB / Rie1 en dos cerdos domésticos inoculados intramuscularmente con este aislado y cuatro animales en contacto ( 25) Por lo tanto, este aislado natural parece ser más efectivo que otras cepas que se han atenuado a través de pasajes sucesivos en las células ( 31 ) o por manipulación genética que han desafiado contra los virus no parentales ( 32 - 34 ). En este sentido, se necesitan más estudios sobre los efectos de protección cruzada de Lv17 / WB / Rie1 contra diferentes genotipos de ASFV, ya que el virulento ASFV Arm07 utilizado como desafío en este estudio también pertenece al genotipo II.

 

Existen muchos estudios sobre la obtención de vacunas de ASF vivas atenuadas por ingeniería genética, puede considerarse como una herramienta potencial para mejorar nuestra vacuna candidata, lo que nos permite eliminar genes virulentos para maximizar la seguridad. Sin embargo, debemos tener en cuenta que algunos genes tienen un papel protector esencial y deben mantenerse. Como el caso de la cepa ASFV NH / P68 atenuada, confiere protección total contra el aislado Arm07, pero después de la manipulación genética, los mutantes de deleción analizados hasta la fecha no demostraron su capacidad para proteger completamente contra el desafío con la cepa de virus virulento heterólogo, reduciendo La eficacia de tales candidatos ( 23 ).

Nuestra observación de que tres jabalíes fueron inmunizados por contacto indica que los animales vacunados por vía oral pueden eliminar el virus de la vacuna. Este desprendimiento, que también se ha descrito para el candidato a la vacuna ASFV NH / P68 atenuada ( 23 ), puede ayudar a amplificar la cobertura de vacunación, reduciendo la necesidad de producción costosa y la administración a gran escala de la vacuna en el campo.

 

Por otro lado, la eliminación del virus de la vacuna puede significar que los jabalíes que se recuperan de la PPA actúan como portadores de virus y aseguran una infección persistente ( 18 , 19 , 35 , 36 ). Sin embargo, dos estudios a largo plazo mostraron que después de la recuperación clínica de la PPA, los animales infectados con PPAV moderadamente virulento pudieron eliminar el virus del suero y los tejidos y no transmitieron el virus a los cerdos centinelas mezclados ( 37 , 38 ). De hecho, los animales supervivientes mostraron altos títulos de anticuerpos durante más de 3 meses después de la infección inicial ( 37 ). Estos resultados concuerdan con los de nuestro estudio, donde los jabalíes VContact vacunados por vía oral mantuvieron altos títulos de anticuerpos Figura ). Mientras que la viremia ( Figura 2 ) y la presencia de ADN viral en los tejidos ( Figura 6 ) disminuyeron durante el experimento, incluso después de la exposición al desafío virulento. Nuestro aislamiento de Lv17 / WB / Rie1 sin hemadsorbing de solo dos tejidos de todos los animales vacunados por vía oral y VContact al final del experimento sugiere un bajo riesgo de infectividad después de los períodos de viremia ( 25), aunque consideramos que este resultado es preliminar ya que no intentamos aislar el virus de todos los tejidos disponibles. Además, se necesitan con urgencia estudios a largo plazo para evaluar la capacidad de Lv17 / WB / Rie1 para persistir y transmitirse entre el jabalí centinela. Esto es especialmente importante dado estudios contradictorios acerca de la capacidad de los animales para actuar como portadores VPPA, que pueden depender de la cepa de virus ( 18 , 19 , 35 - 38 ). También se necesitan más estudios para evaluar la seguridad de Lv17 / WB / Rie1 como vacuna, como para establecer qué sucede cuando los animales reciben una sobredosis y examinar las rutas de eliminación del virus a lo largo del tiempo ( 20 , 39 , 40 ).

 

Nuestra incapacidad para detectar el ADN del ASFV por PCR en tres de los ocho animales sobrevivientes vacunados por vía oral y dos de los tres animales VContact durante el análisis de tejido post mortem sugiere que estos animales habían eliminado completamente el virus. Los animales restantes que sobrevivieron mostraron resultados de PCR débilmente positivos principalmente en los ganglios linfáticos retrofaríngeos y submandibulares, lo que indica que los animales no habían eliminado el virus de la vacuna o que probablemente lo habían eliminado, pero fueron reinfectados por el virus que persistió en los corrales de animales de períodos anteriores de viremia. . Este virus probablemente era Lv17 / WB / Rie1 porque todos los aislamientos de estos animales supervivientes no eran hemadsorbadores. En contraste, los controles desafiados por vía intramuscular y un jabalí no protegido vacunado mostraron resultados de PCR muy positivos en todos los tejidos analizados (ver Figura 5), y el ADN viral era más probable que el de la cepa de desafío Arm07, ya que los aislamientos virales eran hemadsorbadores. Estos hallazgos sugieren que el virus Lv17 / WB / Rie1 se puede eliminar y no se transmite de manera eficiente a largo plazo, al menos en la dosis y la ruta de administración en este estudio. De acuerdo con esta idea, los niveles de ADN viral se correlacionaron inversamente con el intervalo entre la última viremia y la necropsia ( Figura 6 ).

 

Nuestro análisis sugiere que la vacunación ayudó a los dos jabalíes en contacto tardío a recuperarse de la infección por ASFV. Inicialmente después del desafío, su viremia, temperatura y signos clínicos fueron similares a los de los animales con desafío intramuscular ( Figura 2 ), y el ASFV Arm07 hemadsorbing incluso se aisló del ganglio linfático inguinal de un animal en contacto tardío. Posteriormente, sin embargo, los dos animales en contacto tardío mostraron una alta respuesta de anticuerpos a los 7–9 días después del desafío y disminuyeron los signos clínicos y la viremia ( Figura 2 ). Nuestra observación de que ambos animales en contacto tardío mostraron presencia de ADN de ASFV en tejidos de manera similar a los animales sobrevivientes vacunados por vía oral y VContact ( Figura 5) probablemente refleja el hecho de que los animales en contacto tardío estuvieron expuestos a ambos aislamientos al mismo tiempo. De hecho, la recuperación clínica y la eliminación del virus en animales en contacto tardío sugieren que Lv17 / WB / Rie1 puede ser una vacuna altamente efectiva, dado que confiere protección incluso en presencia del aislado virulento Arm07. Estos resultados deben verificarse y extenderse en estudios posteriores de exposición de animales al virus de desafío y de vacuna.

 

Hasta donde sabemos, este es el primer informe de vacunación experimental de jabalí contra el genotipo II de ASFV, y el primer informe de inmunización oral contra cualquier cepa de ASFV en jabalí. En el contexto actual de esta enfermedad transfronteriza, se necesita con urgencia una vacuna oral contra el VPPA en el jabalí como herramienta adicional para reforzar y rediseñar los planes de mitigación debido a que ninguna de las medidas de control aplicadas en las poblaciones de jabalíes afectadas ha sido efectiva ( 7 , 13 , 41) Si se puede establecer la seguridad de Lv17 / WB / Rie1 como vacuna, entonces puede ayudar a mitigar la propagación incontrolada de ASFV en Europa, similar al éxito hasta ahora en detener la propagación de la peste porcina clásica. Los estudios futuros deberían examinar la seguridad de la vacuna después de la administración repetida o una sobredosis, su estabilidad genética durante los pasajes, su estabilidad en el campo y su diferenciabilidad frente a la infección del virus según las pruebas serológicas DIVA.

 

 

 

 

 

Contribuciones de autor

JB, CG, EC-F, MA y JS-V: participaron en el diseño experimental. CG, BR y MA: prepararon las vacunas. JB, CG, EC-F, CJ, BR, AR-B y JS-V: trabajo de campo y laboratorio realizado. JB, EC-F, CJ, BR y JS-V: análisis de datos realizado. JB, EC-F y CJ: redactó el manuscrito. CG, BR, AR-B, MA y JS-V: revisó el manuscrito.

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN ORIGINAL

Frente. Veterinario. Sci.,

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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